纳米抗体（Nbs）工程技术全景：从文库构建、展示筛选到 AI 赋能，加速疾病诊疗应用落地

在抗体药物与诊断试剂领域，纳米抗体（Nanobodies, Nbs）正凭借 “迷你尺寸 + 超强性能” 的独特优势，成为传统单克隆抗体的重要补充 —— 这类仅由重链可变区（VHH）构成的微型抗体，分子量仅 12-15 kDa（约为传统抗体的 1/10），却兼具高稳定性（耐 60℃高温、pH 2-11 酸碱环境）、强特异性（与抗原结合亲和力达 nM-pM 级）与优异组织穿透性（可穿透肿瘤致密基质或血脑屏障）。目前，纳米抗体的工程化生产已形成 “文库构建 - 展示筛选 - 表达纯化” 的成熟流程，而人工智能（AI）的介入更打破了传统实验的效率瓶颈，为其从基础研究向临床应用（如肿瘤靶向治疗、传染病快速诊断）的转化注入新动力。本文将系统解析纳米抗体工程的核心技术环节，聚焦文库构建策略、展示平台特性及 AI 应用突破，探讨其如何推动疾病诊疗技术的革新。

一、文库构建：纳米抗体多样性的 “源头活水”

纳米抗体的筛选效率与应用范围，首要依赖于文库的多样性与针对性 —— 根据抗原已知性、研究目标及资源可及性，目前主流文库分为免疫文库、Naive 文库、合成 / 半合成文库三类，各有明确的技术逻辑与适用场景：

1. 免疫文库：针对已知抗原，追求高亲和力

免疫文库是通过 “抗原免疫驼科动物（骆驼、羊驼）或鲨鱼” 后构建的文库，核心优势是亲和力高（经动物免疫系统亲和力成熟），适合已知抗原的高特异性纳米抗体筛选：

构建流程：将目标抗原多次免疫羊驼后，取外周血分离 B 淋巴细胞，提取总 RNA 并反转录为 cDNA，通过特异性引物扩增 VHH 基因（纳米抗体的核心编码区），再将 VHH 片段插入展示载体（如噬菌体载体），构建免疫文库；性能特点：文库多样性虽仅 10⁶-10⁸（低于 Naive 文库），但含大量针对目标抗原的高亲和力克隆，筛选命中率可达 10⁻⁴-10⁻³，且无需后续亲和力成熟即可满足临床需求；典型应用：新冠病毒刺突蛋白（S 蛋白）纳米抗体筛选 —— 通过免疫羊驼构建 S 蛋白免疫文库，可快速获得能中和病毒的纳米抗体，这类抗体已用于新冠感染的早期治疗与诊断试纸研发。

2. Naive 文库：无需抗原免疫，覆盖广谱靶点

Naive 文库源于未接触过特定抗原的动物（如健康羊驼）或人类外周血 B 细胞，核心优势是无需抗原免疫，适合未知抗原或难以制备的抗原（如膜蛋白、毒性抗原）筛选：

构建逻辑：从多个未免疫个体中收集 B 细胞，批量扩增 VHH 基因，通过引入随机突变（如易错 PCR）进一步提升多样性，最终构建库容达 10⁹-10¹⁰的文库；性能特点：多样性广，可筛选出针对任意抗原的纳米抗体，但亲和力通常较低（μM 级），需后续通过定点突变或 DNA 改组进行亲和力成熟；技术挑战：需大量起始 B 细胞（通常来自 10 只以上健康羊驼）以保证多样性，且筛选工作量大（需筛选 10⁵-10⁶个克隆才能获得阳性候选）。

3. 合成 / 半合成文库：按需定制，聚焦特定功能

合成 / 半合成文库通过 “人工设计 VHH 基因序列” 构建，核心优势是可定制性强，能针对特定靶点（如 GPCR、酶活性中心）设计互补决定区（CDR），适合功能导向的纳米抗体开发：

构建策略：①半合成文库：保留 VHH 的保守框架区（FR），人工合成随机化的 CDR 区（尤其是 CDR3，抗原结合的关键区域）；②全合成文库：基于已知高稳定性 VHH 结构，从头设计 FR 与 CDR 序列，确保理化性质（如溶解度、稳定性）优异；性能特点：可精准控制 CDR 区的氨基酸组成（如增加疏水残基提升膜蛋白结合能力），且文库可无限扩增（无需依赖动物资源），适合工业级规模化筛选；典型案例：针对肿瘤标志物 HER2 的合成文库 —— 通过设计 CDR3 区的酸性氨基酸残基（与 HER2 的碱性结构域互补），筛选获得的纳米抗体对 HER2 阳性肿瘤细胞的结合特异性较传统抗体提升 2 倍。

二、展示平台：纳米抗体筛选的 “高效筛子”

文库构建后，需通过展示平台将纳米抗体 “呈现” 出来，再利用抗原进行亲和筛选 —— 目前主流平台分为噬菌体展示、细胞表面展示、非表面展示三类，各有技术优势与适配场景：

1. 噬菌体展示：成熟高效，高通量筛选首选

噬菌体展示是纳米抗体筛选最成熟的平台，基于丝状噬菌体（如 M13、fd）的结构蛋白（pⅢ、pⅧ）融合展示，核心优势是高通量、低成本：

筛选流程：将 VHH 基因与 pⅢ 基因融合，构建重组噬菌体文库；将抗原固定在固相载体（如酶标板、磁珠）上，与噬菌体文库孵育后，洗涤去除非特异性结合的噬菌体，洗脱结合的阳性噬菌体并感染大肠杆菌扩增，经 3-5 轮 “吸附 - 洗脱 - 扩增” 循环，富集目标纳米抗体；性能优势：库容大（可处理 10¹⁰以上克隆）、筛选周期短（2-3 周）、假阳性率低（通过多轮筛选排除非特异性克隆），且可直接关联 VHH 基因（筛选后测序即可获得序列）；局限：部分纳米抗体在大肠杆菌中折叠不佳，可能导致假阴性（实际能结合抗原但未正确展示）。

2. 细胞表面展示：功能导向，直接检测活性

细胞表面展示（以酵母、大肠杆菌为宿主）将纳米抗体展示在细胞表面，核心优势是可直接检测功能活性（如抗原结合、酶抑制），适合筛选需正确折叠的功能型纳米抗体：

技术原理：将 VHH 基因与酵母表面蛋白（如 Aga2p）或细菌外膜蛋白（如 OmpA）融合，使纳米抗体展示在细胞表面；通过流式细胞术（FACS）筛选能与荧光标记抗原结合的细胞，直接获得阳性克隆；独特价值：纳米抗体在真核细胞（如酵母）中可进行翻译后修饰（如二硫键形成），适合筛选需修饰才能折叠的纳米抗体（如针对蛋白酶的抑制性纳米抗体）；且可通过荧光强度量化结合亲和力，快速筛选高活性克隆；局限：库容较小（通常≤10⁷），不适合超大规模筛选。

3. 非表面展示：无细胞系统，突破宿主限制

非表面展示（如核糖体展示、mRNA 展示）无需宿主细胞，直接在无细胞系统中实现 “纳米抗体 - 编码 mRNA/DNA” 的偶联，核心优势是无宿主毒性限制，适合筛选毒性纳米抗体（如抑制细胞必需酶的纳米抗体）：

技术逻辑：核糖体展示中，VHH mRNA 翻译时与核糖体结合，形成 “mRNA - 核糖体 - 纳米抗体” 三元复合物，通过抗原亲和筛选捕获复合物后，提取 mRNA 反转录为 cDNA 进行扩增；适用场景：筛选能结合细胞毒性抗原（如细菌毒素）或抑制关键酶（如肿瘤细胞的端粒酶）的纳米抗体 —— 这类纳米抗体若在细胞中表达可能导致宿主死亡，而无细胞系统可规避这一问题；挑战：技术操作复杂，需优化无细胞翻译体系，且 RNA 易降解，筛选稳定性需提升。

三、AI 赋能：纳米抗体工程的 “效率革命”

传统纳米抗体开发依赖 “试错法”，如亲和力成熟需构建大量突变体，耗时耗力；而 AI 凭借蛋白质结构预测、分子互作模拟、突变设计优化的强大能力，正重构纳米抗体工程的流程，大幅提升效率与精度：

1. AI 预测纳米抗体结构：替代传统结构解析，节省时间成本

纳米抗体的结构（尤其是 CDR 区构象）直接决定其抗原结合能力，传统解析方法（如 X 射线晶体衍射、冷冻电镜）需数月至数年，而 AI 工具可实现 “序列→结构” 的快速预测：

代表工具与应用：AlphaFold2、RoseTTAFold 可根据 VHH 氨基酸序列，在数小时内预测出高精度三维结构（与实验解析结构的 RMSD<1Å）；例如，针对流感病毒血凝素（HA）的纳米抗体，AI 预测其 CDR3 区形成 “凸环结构”，可插入 HA 的受体结合位点，后续实验验证该结构与预测完全一致，省去了结构解析的 6 个月周期；价值延伸：AI 可预测纳米抗体的稳定性热点（如 FR 区的疏水残基），指导突变设计（如将不稳定残基突变为脯氨酸），提升纳米抗体的体内半衰期（如从 2 小时延长至 12 小时）。

2. AI 模拟分子互作：预测结合亲和力，缩小筛选范围

纳米抗体与抗原的结合亲和力是临床应用的关键指标，传统需通过 SPR、ELISA 实验测定，而 AI 可通过分子对接与动力学模拟，提前预测结合能力：

技术流程：将 AI 预测的 VHH 结构与抗原结构进行分子对接，通过计算结合自由能（ΔG）预测亲和力；再通过分子动力学模拟（如 GROMACS）分析复合物的稳定性，排除结合构象不稳定的候选；实际案例：在新冠病毒 N 蛋白纳米抗体筛选中，AI 从 1000 个候选序列中预测出 20 个高亲和力克隆（ΔG<-8 kcal/mol），实验验证其中 18 个的亲和力达 nM 级，命中率从传统的 1%-2% 提升至 90%，大幅减少实验工作量。

3. AI 优化理化性质：降低免疫原性，提升临床适用性

纳米抗体进入人体后可能引发免疫原性（如抗药物抗体 ADA），或因溶解度差导致聚集，传统优化需大量突变筛选，而 AI 可精准设计突变：

免疫原性优化：AI 通过分析 VHH 序列中的 T 细胞表位（如 MHC II 结合基序），设计突变消除表位，例如将某肿瘤靶向纳米抗体的 T 细胞表位残基突变为丙氨酸后，免疫原性降低 90%，且不影响抗原结合；溶解度与稳定性优化：AI 通过训练大量抗体序列 - 理化性质数据，预测影响溶解度的残基（如表面疏水残基），指导突变设计；例如，某抗凝血纳米抗体经 AI 优化后，溶解度从 5 mg/mL 提升至 20 mg/mL，满足静脉注射需求。

四、挑战与未来：纳米抗体工程的 “进阶方向”

尽管纳米抗体工程已取得显著进展，仍面临三大挑战：①合成文库的多样性需进一步提升（目前最大库容约 10¹¹，尚未覆盖所有可能的 VHH 序列）；②AI 预测依赖高质量数据集，针对罕见抗原的纳米抗体数据不足可能导致预测偏差；③展示平台的假阳性问题（如噬菌体展示中载体自身结合抗原）需更严格的对照设计。

未来，随着 “AI + 高通量实验” 的深度融合（如 AI 预测候选后通过微流控芯片快速验证）、多模态展示平台的开发（如噬菌体 - 酵母混合展示），纳米抗体的开发周期将从目前的 6-12 个月缩短至 1-2 个月，且性能（亲和力、稳定性、安全性）将进一步提升。

泰克生物聚焦纳米抗体工程技术支撑，助力科研人员高效获得高特异性、高稳定性的纳米抗体，加速疾病诊疗试剂与靶向药物的研发进程。